农业农村部新闻办公室4月7日发布，西藏自治区林芝市发生非洲猪瘟疫情。截至目前，全国仅海南、香港、澳门和台湾没有发生非洲猪瘟疫情。宿主感染ASFV后的症状取决于病毒和宿主之间复杂的相互作用。家猪感染ASFV后以急性出血热和高死亡率为特征。严格的细胞嗜性表明受体介导的内吞是ASFV入侵的主要机制，然而病毒结合和入侵的受体仍然未知。目前对ASFV感染识别机制仍知之甚少。在ASFV强毒感染的巨噬细胞中，Ⅰ型IFN通路被抑制。
大家好，今天给大家分享一篇最近发表在Virus Research上的一篇综述：African swine fever virus evasion of host defenses，本文作者是来自英国Pirbright研究所的Linda K Dixon教授。
农业农村部新闻办公室4月7日发布，西藏自治区林芝市发生非洲猪瘟疫情。截至目前，全国仅海南、香港、澳门和台湾没有发生非洲猪瘟疫情。目前在亚洲地区已有中国、越南、蒙古和柬埔寨四国报道非洲猪瘟疫情，非洲猪瘟在全球范围内进一步扩张！了解非洲猪瘟病毒（ASFV）和宿主的相互作用以及病毒如何调控宿主的免疫应答可为疫苗的研发奠定理论基础。本文概述了ASFV如何利用自身基因编码的蛋白抑制宿主免疫应答，总结了ASFV单个或多个基因的敲除对其在细胞中复制能力以及对猪致病力的影响。
宿主感染ASFV后的症状取决于病毒和宿主之间复杂的相互作用。ASFV的自然宿主疣猪和薮猪通常表现为持续感染且无明显的临床症状，这可能是长期适应的结果。栖息于疣猪洞穴的软蜱（Ornithodoros moubata）是ASFV的生物学媒介和储存宿主，在传播循环过程中发挥关键作用。家猪感染ASFV后以急性出血热和高死亡率为特征。大部分ASFV对家猪可造成急性感染，但某些低致病力毒株感染后也可形成亚急性感染，30%~50%感染猪可以存活，甚至还有一些低致病力毒株感染家猪后几乎不表现出临床症状，死亡率也很低。随着人们在分子、细胞和动物个体水平上对ASFV和宿主相互作用的认识不断加深，对ASFV感染宿主后表现出不同症状这一现象提出了新的见解，也促进了ASFV防治包括疫苗研制的进一步发展。
表1 ASFV基因组的非必需基因
ASFV细胞嗜性
ASFV具有严格的细胞嗜性，主要感染巨噬细胞和单核细胞，也可在树突状细胞中复制。这些细胞都在诱导天然免疫中发挥着关键作用，可以将病毒抗原提呈给T细胞激活适应性免疫。巨噬细胞是识别和抵抗病原微生物感染以及启动炎性应答的专职细胞。树突状细胞则能响应炎性应答成为有效的抗原提呈细胞，并且迁移至次级淋巴组织的T细胞区。
ASFV在巨噬细胞和单核细胞中的复制
ASFV通过受体介导的网格蛋白依赖的内吞和巨胞饮入侵巨噬细胞和单核细胞。严格的细胞嗜性表明受体介导的内吞是ASFV入侵的主要机制，然而病毒结合和入侵的受体仍然未知。早期研究表明CD163可能是ASFV受体，然而CD163敲除猪依然对ASFV易感。细胞内成熟病毒粒子和细胞外病毒囊膜病毒粒子都具有感染性。ASFV粒子的外层囊膜在出芽时从宿主细胞膜获得，在酸性的内体环境中可脱去。内层囊膜则和内体膜融合将ASFV核心释放到细胞质中，从而启动复制周期。一些病毒蛋白如p54/pE183L、p30/pCP204L和p12/pO61R在病毒吸附和入侵过程中发挥重要作用。
ASFV在树突状细胞中的复制
猪的树突状细胞（DCs）可以分为两个主要的亚群：常规树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）。cDCs是专职的抗原提呈细胞。pDCs是Ⅰ型干扰素（IFN）产生细胞，通过上调MHC-Ⅰ类分子和Ⅱ类分子的表达促进DCs的成熟和启动适应性免疫应答。有证据表明DCs对ASFV也易感。最新研究表明单核细胞来源的树突状细胞（MoDCs）对ASFV强毒和弱毒都易感，它在IFNα刺激成熟下对弱毒的易感性降低，却对强毒株的易感性升高。体外感染实验表明pDCs也能分泌Ⅰ型IFN，这就解释了为什么急性ASFV感染的动物血清含有高水平的Ⅰ型IFN。目前对DCs在抗ASFV感染中的作用研究较少。
巨噬细胞对ASFV感染的应答
巨噬细胞的可塑性较少，对细胞内信号的反应可以采用不同的表型和功能，包括：激活吞噬作用、细胞体积增大、细胞因子和趋化因子等分泌信号的激活。
克服单核/巨噬细胞中的复制障碍
为了克服在巨噬细胞中不利的复制环境，ASFV编码参与碱基切除修复（BER）途径的酶。DNA损伤能在病毒基因组中引入致死性突变，或抑制病毒DNA/RNA聚合酶活性从而降低病毒复制。在BER途径中，DNA修复聚合酶X、AP核酸内切酶和DNA连接酶对病毒巨噬细胞中的复制是必需的。BER途径的必需成分全部装配进ASFV粒子中，用于病毒核心颗粒入侵后的早期复制。
ASFV也编码核苷酸代谢的酶如胸苷激酶，这种酶对ASFV在巨噬细胞中的有效复制是必需的。研究表明dNTPs水平的升高对病毒基因组的复制也是必需的，然而dNTPs在未分化的巨噬细胞中水平较低。ASFV Georgia分离株TK基因的敲除降低了病毒对猪的致病力，可能是病毒在巨噬细胞中的复制能力降低的结果。
调控Ⅰ型干扰素应答
Ⅰ型IFN的诱导需要细胞质膜上或胞质内或内体膜上的模式识别受体（PRRs）识别病原相关分子模式（PAMPs），包括病毒DNA或RNA。病毒DNA可被cGAS识别继而催化ATP和GTP合成cGAMP，随后cGAMP结合内质网定位的STING。STING构象改变招募TBK1对NF-κB和IRF3磷酸化激活后入核启动Ⅰ型IFN转录表达。病毒RNA则激活RIG-Ⅰ和MDA-5，继而激活线粒体MAVS向下游传递信号激活IRF3。内体膜上的TLRs也能识别外源核酸。其中，TLR3识别双链RNA激活TRAF3和TBK1，进而激活IRF3。理论上，ASFV作为主要在胞质中复制的DNA病毒，DNA感受器信号通路在ASFV识别和Ⅰ型IFN诱导过程中发挥关键作用。然而，病毒DNA也可被宿主RNA聚合酶Ⅲ或病毒RNA聚合酶转录生成dsRNA，因此RNA感受器可能也在ASFV识别过程中发挥重要作用。目前对ASFV感染识别机制仍知之甚少。
ASFV编码多基因家族（MGFs）抑制Ⅰ型IFN应答。在ASFV强毒感染的巨噬细胞中，Ⅰ型IFN通路被抑制。MGF360和MGF505/530缺失病毒感染的巨噬细胞中Ⅰ型IFN和ISGs表达上调。MGF360-15R（A276R）通过抑制TLR3和胞质感受器信号通路进而抑制IRF3，而不依赖IRF7和NF-κB途径抑制Ⅰ型IFN的产生。MGF505-7R（A528R）则通过抑制IRF3和NF-κB抑制Ⅰ型IFN的产生。因此，A528R可能抑制Ⅰ型和Ⅱ型IFN信号通路，但具体机制不明确。
ASFV pI329L是TLR3类似物，它是一种高度糖基化的蛋白，定位于细胞膜，通过抑制TLR3介导的NF-κB和IRF3激活进而抑制IFN-β产生。研究表明，pI329L可能靶向TRIF，过表达TRIF能拯救pI329L对NF-κB和IRF3激活的抑制。
调控IFN应答通路
分泌的Ⅰ型IFN（α/β）结合病毒感染细胞和邻近未感染细胞表面受体后，启动JAKs STATs通路，通过磷酸化激活STAT1和STAT2，二聚化结合IRF9后ISGF3复合物入核启动ISGs表达。ISGs包括细胞因子、趋化因子、和其他激活天然免疫和适应性免疫先关的蛋白，ISGs具有多种功能，能有效抑制病毒复制。
用Ⅰ型IFN预处理细胞后能激活ISGs引起抗病毒状态，但不能抑制ASFV强毒株的复制，说明ASFV具有多种机制抑制Ⅰ型IFN应答和抗病毒状态。敲除MGF360和MGF505/530的ASFV对Ⅰ型IFN敏感，表明这些基因具有抑制IFN应答和抗病毒状态的功能。
对ASFV强毒株的MGF360和MGF505/530的多个拷贝的基因敲除后，不影响病毒在巨噬细胞中的复制能力，但免疫后对家猪的致病力降低，也能诱导对强毒攻毒的免疫保护，其保护水平和免疫剂量、亲本毒株类型和缺失的基因有关。
以上结果表明，Ⅰ型IFN系统对控制ASFV在感染猪中的复制和诱导保护性免疫应答中发挥重要作用。ASFV感染的巨噬细胞中Ⅰ型IFN表达的上调能引起邻近细胞中信号放大以及诱导ISGs生成激活天然免疫应答以减少病毒复制。仅诱导抗病毒状态对抑制ASFV复制的作用是有限的，还需要激活和招募天然免疫细胞协同控制ASFV复制水平，这也为激活和指导适应性免疫应答来清除感染争取了时间。
体内调控IFN应答
研究表明ASFV能够抑制Ⅰ型和Ⅱ型IFN的表达。然而，体内实验表明，强毒感染的动物血清中能检测到IFNα和IFNβ的存在。
抑制细胞凋亡
诱导凋亡是细胞应对病毒感染普遍存在的一种保护性反应，能够有效抑制病毒复制和传播。相应的，病毒也进化出各种机制来抑制感染细胞的凋亡。ASFV编码多种抑凋亡蛋白，通过多种途径抑制感染细胞的凋亡。
图1 ASFV抑制细胞凋亡
Bcl-2家族成员A179L
A179L是Bcl-2家族成员，根据其4个Bcl-2同源区和与同家族其他蛋白互作的情况，Bcl-2家族成员分为促凋亡蛋白和抑凋亡蛋白。促凋亡蛋白包括BH3-only蛋白，能够识别细胞损伤启动死亡程序。Bak和Bax负责维持线粒体膜的完整性，激活后能破坏线粒体膜电位，引起细胞色素c（cytc）释放，形成Apaf1/cytc/caspase9复合物，进而激活caspase3/7，启动细胞凋亡。
BH3-only蛋白包括Bim、Bid、Puma、Noxa、Bmf、Bik、Bad和Hrk，它们通过直接激活Bak和Bax，或者隔离中和Bcl-2蛋白来促进细胞凋亡。A179L含有所有的BH结构域，能和促凋亡的BH3-only蛋白发生广谱的相互作用。研究表明，A179L对截短的Bid、Bim、Puma和BaK、Bak下游蛋白具有高亲和力。A179L对促凋亡BH3结构域蛋白的广谱高亲和力能够确保ASFV有效抑制多种感染宿主细胞的凋亡。A179L也能通过结合Beclin1的BH3结构域抑制细胞自噬。
A179L表达于ASFV感染的早期和晚期，但不组装进成熟的病毒粒子中，表明A179L在整个ASFV感染过程中抑制细胞凋亡，而不是在病毒粒子核心进入胞质的早期。
凋亡家族成员抑制物A224L
ASFV A224L蛋白是凋亡抑制蛋白（IAP）家族成员，含有BIR模体。A224L能抑制TNF-α刺激引起的细胞凋亡。在A224L基因缺失的ASFV感染细胞中，caspase3活性升高，表明A224L通过抑制caspase3的激活而抑制细胞凋亡，但其具体机制尚不明确。研究表明，表达A224L能够激活NF-κB，继而促进抑凋亡基因包括IAP和Bcl-2家族成员的转录表达。激活NF-κB也能促进cFLIP表达，抑制capsase8。A224L表达于感染晚期并被组装进成熟的病毒粒子，表明其能在病毒核心进入胞质的早期和感染晚期抑制细胞凋亡。
对ASFV强毒的A224L基因进行敲除后，不降低病毒在巨噬细胞中的复制和对家猪的致病力。ASFV可能编码其他蛋白抑制细胞凋亡来补偿A224L功能的缺失，或者TNF-α受体介导的凋亡在ASFV体内感染过程中并不起主要作用。
抑制应激诱导的细胞凋亡
ASFV感染能激活细胞内质网应激（ER Stress）和未折叠蛋白反应（UPR），继而激活内质网驻留蛋白激酶（PERK）。病毒感染也常常会激活PKR。激活的PERK和PKR能对真核翻译起始因子eIF2α去磷酸化，恢复细胞内蛋白质的大量合成。ASFV DP71L能和蛋白磷酸酶1（PP1）互作，对eIF2α去磷酸化，恢复蛋白质的大量合成。因此促凋亡转录因子CHOP被抑制，进而抑制CHOP介导的细胞凋亡。HSV-1 编码的ICP34.5和宿主蛋白GADD34也能和PP1互作对eIF2α去磷酸化。这些蛋白和DP71L都含有保守的C基末端结构域。DP71L基因敲除的Malawi Lil20/1或E70毒株感染的细胞中，eIF2α的磷酸化水平和CHOP水平仍然被抑制，表明ASFV还编码其他蛋白抑制该途径。DP71L是一些但不是所有ASFV毒株的毒力基因。例如，DP71L（longform）基因敲除的Malawi Lil20/1和DP71L（shortform）基因敲除的Pretoriuskop/96/4 ASFV毒株依然造成感染家猪的100%死亡率。相反，敲除DP71L（short form）的E70毒株的毒力得到致弱。一个可能的解释是ASFV编码其他蛋白能够补偿DP71L功能的缺失。
ASFV C-型凝集素样蛋白pEP153R
pEP153R通过抑制p53途径和抑制caspase3的激活抑制细胞凋亡。EP153R基因敲除后不影响ASFV强毒对家猪的致病力。
体内诱导邻近细胞凋亡
ASFV通过多种机制抑制细胞凋亡，然而在感染晚期却能观察到细胞凋亡。感染晚期的凋亡能促进病毒的传播和单核/巨噬细胞摄取凋亡小体，因而能逃逸细胞坏死诱导的炎性反应。体内实验也观察到感染的单核/巨噬细胞凋亡。急性ASFV感染的特征之一是淋巴结和血液中存在大量未感染的B细胞和T细胞凋亡，但具体机制未知。推测感染细胞通过分泌或提呈细胞表面的某些分子诱导邻近未感染细胞发生凋亡。由于凋亡引起淋巴细胞的大量破坏也会造成免疫抑制。
ASFV抑制炎症反应
pA238L蛋白调控炎症反应
pA238L蛋白和IκB分子相似。NF-κB不仅能激活Ⅰ型IFN启动子，还能促进大量参与炎症反应的基因转录激活。一开始，研究人员发现，pA238L蛋白能够抑制NF-κB激活。随后又发现，pA238L蛋白还能抑制钙调磷酸酶（CaN），因此抑制该酶激活的下游通路，包括NF-AT。在正常细胞中，NF-AT在胞质中处于高度磷酸化状态，当其被钙依赖性磷酸酶去磷酸化后能入核启动NF-AT依赖的基因转录表达。研究发现，pA238L蛋白在多种分子的介导下，和转录共激活分子p300/CBP的N-末端结构域结合，从而抑制NF-ATc2、NF-κB和c-Jun等的激活。pA238L表达于病毒感染早期，能在胞质和胞核之间穿梭。通过pA238L表达分析和基因缺失分析发现，pA238L蛋白是有效的抗炎性证反应蛋白，不仅能够抑制TNF-α的生成，还可抑制TNF-α、诱生型一氧化氮合酶和环加氧酶激活的下游信号通路。ASFV强毒缺失A238L基因后不影响病毒在巨噬细胞中的复制和对家猪的致病力。
L83L结合IL-1β
L83L基因位于ASFV基因组左侧末端，编码83个氨基酸蛋白。酵母双杂交实验表明，pL83L蛋白能结合IL-1β。作者认为pL83L蛋白能够调控促炎性细胞因子的功能。L83L基因缺失后不影响ASFV在巨噬细胞中的复制和对家猪的致病力。pL83L蛋白的功能还需要进一步研究。
ASFV吸附蛋白CD2v的功能
EP402R基因编码Ⅰ型跨膜蛋白，也称为CD2v、CD2v-like、5HL、pEP402R和8-DR。ASFV pEP402R/CD2v蛋白的胞外结构域和宿主蛋白CD2分子同源，并且含有两个Ig样结构域。ASFV pEP402R/CD2v蛋白在病毒传播和免疫逃逸中发挥重要作用，它负责将红细胞吸附（HAD）到感染细胞表面和胞外病毒粒子吸附到红细胞表面。ASFV感染PBMC能抑制有丝分裂原依赖的淋巴细胞增殖。EP402R基因缺失的病毒则不能抑制淋巴细胞增殖，表明该蛋白具有免疫调节功能。感染猪产生的抑制红细胞吸附的抗体具有交叉保护作用，表明该蛋白能诱导保护性抗体产生。pEP402R/CD2v蛋白是唯一被确定的存在于病毒粒子外层囊膜上的蛋白，暗示其可能在病毒入侵和胞间传播中发挥重要作用。
pEP402R/CD2v蛋白的胞质区含有数量不等的丰富的脯氨酸，能和SH3结构域蛋白如SH3P7和mAbp1结合。该蛋白能和actin结合介导囊泡运输。CD2v蛋白也能和AP-1互作。研究表明，pEP402R/CD2v蛋白可能在囊泡运输中发挥关键作用，将pEP402R/CD2v蛋白的胞质区切割后则丧失该功能。pEP402R/CD2v蛋白对猪的致病力取决于病毒的遗传背景。大多数ASFV毒株都能诱导HAD并且表达功能性pEP402R/CD2v蛋白。然而，少数ASFV毒株不能诱导HAD。研究人员将ASFVEP402R基因敲除后免疫家猪，尽管推迟了临床症状，降低了病毒传播能力，然而却不影响病毒的致病力。最近研究表明敲除BA71株EP402R后病毒被致弱，且能诱导强毒的攻毒保护。EP402R通过促进蜱中肠对病毒的摄取促进病毒在蜱中的复制。由于软蜱在病毒向疣猪传播中发挥关键作用，EP402R可能在选择压力下保留了该功能。
尽管研究人员在ASFV 与宿主相互作用的研究中已取得巨大进展，仍然还有许多未知等待进一步的探索。目前关于单核细胞和巨噬细胞对ASFV具有的易感性，以及树突状细胞在ASFV感染免疫应答中的作用仍知之甚少。ASFV蛋白质组图谱为病毒入侵机制、疫苗靶点和防控ASFV感染策略的研究奠定了基础。ASFV基因组的特征之一是编码多个MGFs。其中，MGF360和MGF505/530是重要的致病因子，能够抑制Ⅰ型IFN产生和应答，然而对其作用机制和该家族中单个基因的功能研究仍较少。除此之外，I329L也能拮抗TLR3信号通路，但其在感染细胞和体内的作用机制有待进一步研究。
ASFV编码多个蛋白抑制细胞凋亡。其中，A179L是Bcl-2家族成员，能广谱抑制BH3-only结构域促凋亡蛋白。DP71L能够恢复细胞内蛋白质的大量合成，通过下调CHOP来抑制内质网应激诱导的细胞凋亡。对DP71L基因进行敲除后，ASFV可编码其他蛋白抑制该途径，这一结论仍需要进一步研究来证实。
原创： handsome 中国动物传染病学报
